骨质疏松症(OP)是一种全身性骨病，其特征是骨量减少、骨组织微结构破坏、骨脆性增加和骨折风险增加。OP发病率高，病程长，并发症严重。益骨汤(YGD)是一种用于治疗OP的中药复方，然而其在OP中的作用机制尚不清楚。

1.YGD缓解OP的能力

为了探索YGD减轻OP的能力，作者首先构建了OP的大鼠模型并测量了骨密度。结果显示，模型组骨密度值明显低于正常组，说明OP大鼠模型建立成功。与模型组相比，YGD组骨矿物质密度(BMD)显著增加(表1)。同时观察了大鼠右股骨的病理组织形态，与正常组相比，模型组骨小梁可见面积变小，宽度变窄，皮质变薄，数量减少，形态结构不规则，排列紊乱，骨髓扩张。YGD给药3个月后，YGD组大鼠与正常组相似，骨小梁稍细，形态规则，排列有序，局部间隙稍扩大(图1)。

图1 大鼠右侧股骨病理观察

2.YGD处理后差异蛋白的TMT蛋白质组学和生物信息学分析

通过TMT定量蛋白质组学分析，从对照组(control)、OP模型组(model)和YGD干预的OP模型的骨组织中共鉴定到3382个蛋白质，3363个匹配显示出高度相似性(图2)。

图2 鉴定及定量结果统计图

进一步筛选实验数据分析不同组之间的差异表达蛋白，结果表明共有65种蛋白质在处理后发生显著变化，与模型组相比，YGD组26种蛋白显著上调，39种蛋白显著下调。然后使用层次聚类算法对比较组的差异表达蛋白质进行分组，结果显示显著差异表达的蛋白质可以有效分离对照组，表明差异表达蛋白的筛选可以代表生物处理对样品的影响。

图3 YGD处理后差异表达蛋白的TMT定量蛋白质组学分析。(a) 火山图；(b) 层次聚类结果的树型热图。

3.差异蛋白的功能分析

通过GO和KEGG分析YGD处理后差异表达蛋白的生物学功能。GO功能富集分析共获得1656个GO terms，包括1195个生物过程(BP)、218个细胞成分(CC)和243个分子功能(MF)。前20个功能富集如图4a-c所示，在与OP相关的生物过程中观察到显著差异，例如蛋白质调节和肌肉调节，酶调节的分子功能以及定位蛋白胶原三聚体。KEGG通路富集分析发现93个信号通路发生了显著变化，主要涉及的信号通路包括蛋白质消化吸收信号、维生素消化吸收信号、甲状腺激素合成(TH信号)和转化生长因子-β(TGF-β)信号通路(图4d)。

图4 (a) 生物过程分类下的GO功能富集；(b) 细胞成分分类下GO功能富集；(c) 分子功能分类下GO功能富集；(d) KEGG通路(top20)富集分析气泡图。

膳食蛋白质参与肠道的生理功能，控制氨基酸、糖、脂代谢，使骨细胞维持正常的生理功能，蛋白质消化吸收信号通路可能主要通过肠道菌群发挥作用，从而影响骨钙代谢。随着年龄的增长，通过肠道菌群对维生素的吸收明显减少，最重要的变化是维生素D吸收的减少，而这种维生素D吸收的减少又会导致OP的发生。在维生素消化吸收信号通路中发现维生素B也参与其中，已有研究证明维生素B1、B12(钴胺素)和 B9(叶酸)具有骨骼保护作用。在此研究中，作者认为中药的使用可能通过该途径调节大鼠体内B族维生素的含量并保护骨组织。TH直接参与骨细胞的发育并控制骨骼的线性生长和成熟，这需要蛋白质来提供足够的能量。TGF-β是主要的转化生长因子，TGF-β信号传导障碍是炎症性疾病的基础，在OP中起重要作用。因此，YGD可能直接或间接参与该信号通路的调控，影响骨代谢，从而在一定程度上控制OP的发生和发展。

4.蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)分析

蛋白质发挥作用的一个重要机制是通过与其他蛋白质的相互作用以及通过蛋白质介导的途径或复合物的形成来调节生物过程。根据PPI网络分析，65个差异表达蛋白中共有21个可能直接相互作用，Alb、DCN、Col6a2和Smad2以多种方式参与其中。此外还发现差异表达的蛋白质DPP4也在图中，这是一种与糖尿病密切相关的蛋白质，这种蛋白质也可能参与并影响骨代谢途径(图5)。

图5 差异蛋白互作网络图

Alb在人体血液中含量丰富，主要参与各种物质的运输，还可增强骨形成。有研究证明血清Alb含量与OP有直接关系，低蛋白饮食可导致骨密度降低，最终引发OP。根据实验结果，Alb蛋白的下调可能是通过TH信号通路，通过下调Alb蛋白从而抑制破骨细胞生成蛋白的表达并刺激破骨细胞凋亡。核心蛋白聚糖(DCN)是骨骼分泌的几种糖胺聚糖(GAG) 非胶原蛋白之一，它的特点是骨骼中富含亮氨酸的重复核心蛋白。DCN可以在动态环境中直接与TGF-β相互作用，从而影响细胞迁移。在此研究中DCN蛋白的下调可能是通过TGF-β信号通路抑制骨骼肌的纤维化反应。通过降低DCN的含量，可以实现骨矿化的加速，减少骨质流失，促进成骨细胞的活性。Smad2是骨形态发生蛋白(BMP) 和调节线粒体功能和细胞凋亡的TGF-β信号通路的主要传感器。根据研究结果，Smad2蛋白的下调同样证实了YGD 可能通过TGF-β信号通路抑制骨重塑并降低破骨细胞活性。此外，YGD 调节的蛋白质中 与糖尿病密切相关的DPP4蛋白表达显著增加，可能表明不同的信号通路对骨形成和骨吸收具有促进作用。

利用基于TMT的蛋白质组学技术和蛋白质组微阵列技术，研究了YGD对骨组织中蛋白质表达的影响。结果表明，YGD参与了与OP相关的多条信号通路，部分蛋白参与了信号通路的调控，证实了YGD参与不同靶蛋白的调控，通过多种信号通路参与信号转导，发挥治疗作用。同时发现差异表达蛋白DPP4与OP存在一定的关系，但DPP4如何参与信号通路转导，影响OP的发生发展值得进一步研究。

文章链接：

https://doi.org/10.1186/s12014-021-09330-0

参考文献：

Ruikun Z. Kun Yan Y. lun W. et al. Quantitative proteomics reveals the effect of Yigu decoction (YGD) on protein expression in bone tissue. Clin Proteom, 2021, 18:24.

编辑丨Aaliyah

审核丨Tao Li