蚊子可携带多种病毒和寄生虫，因此是传播多种病原体的重要媒介。蚊子传播的西尼罗河病毒使许多北美鸟类种群因数量锐减，某些夏威夷本土鸣禽更是因蚊子传播的禽疟疾而灭绝，而蚊子传播的登革热、寨卡热等疾病每年累及全球数亿人，严重危害生物多样性和人类生命安全，控蚊灭蚊形势仍然严峻[1]。

日常生活中，使用杀虫剂仍是灭蚊的主流方式，杀虫剂种类大多为拟除虫菊酯类杀虫剂。杀虫剂的过度使用使蚊子受到了选择压力，产生了抗性，蚊子的抗性机制主要是以下三种：①钠通道靶点敏感性的改变，导致击倒抗性（kdr）；②由于角质层的改变而减少杀虫剂的渗透性；③解毒酶的活性增加。此前，Sene NM等人从基因表达水平上研究蚊子杀虫剂抗性的分子机制，发现杀虫剂抗性蚊子解毒相关基因显著过表达[2]，而准确定位那些与杀虫剂抗性有关的基因仍然具有挑战性。

近年来，伴随着蛋白质技术和蛋白质组学、质谱、生物信息学工具和基因本体注释方法的发展，使蛋白质表达谱绘制、大规模量化和鉴定成为可能。同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）是一种强大的蛋白质组定量分析技术，特别适用于没有完整基因组序列的物种，如淡色库蚊（Cx. pipiens pallens，以下简称Cx），这有助于开发淡色库蚊蛋白质组数据库。最后，在整个蛋白质组水平上理解杀虫剂抗性的分子机制可能最终促进控蚊策略的改进，设计出有效和可持续的控蚊方法。

研究对象：山东省济宁市唐口村地区淡库色蚊（未接触杀虫剂，山东省寄生虫病研究所提供）；

实验分组：氯氰菊酯杀虫剂抗性组、氯氰菊酯杀虫剂敏感组；

实验过程：将氯氰菊酯敏感株在幼虫时期使用氯氰菊酯以半致死浓度（LC50）反复筛选30代，产生稳定的氯氰菊酯抗性株。收集氯氰菊酯敏感株和抗性株不同发育阶段（卵、幼虫、蛹、成虫）的淡色库蚊，取三个平行。提取两组淡色库蚊不同发育阶段的蛋白质，使用iTRAQ试剂标记各组样品蛋白质，使用配备有Proxeon EASY nLC 1000和LTQ Orbitrap Elite18耦合的NanoLC 1000液相色谱系统，进行LC-MS/MS分析鉴定，随后进行蛋白质组学分析，辅以PRM进行验证。

1.‍抗性株和敏感株不同发育阶段差异蛋白的分布

图1 氯氰菊酯抗性株和敏感株不同发育阶段差异蛋白分布

注：Cx_cym：氯氰菊酯抗性株；Cx_s：氯氰菊酯敏感株；egg：卵时期；larvae（la）：幼虫期；pupae（pu）：蛹时期；adult（ad）：成虫期。

图2 氯氰菊酯抗性株和敏感株不同发育阶段差异蛋白动态计数图

2.皮肤发育是抗性的重要参与者

为了解在氯氰菊酯的选择压力下，Cx抗性株和敏感株差异蛋白的生物功能，对成虫阶段的差异蛋白进行GO功能相似性聚类。结果显示，在“皮肤发育”模块中，分别由皮肤发育、成虫寿命决定、毛囊发育、心血管系统发育、循环系统发育、衰老、胚胎肢体发生、骨化负调控、表皮细胞分化调控、轴突引导、系统过程、飞行行为和组织发育13个术语组成，并显示出独特的生物激活。因此，“皮肤发育”显著揭示了杀虫剂氯氰菊酯抗性发展，并指出了不同的干扰途径以及氯氰菊酯靶向的区别性细胞受体。

图3 氯氰菊酯抗性株和敏感株成虫差异蛋白GO功能相似性聚类图

3.渗透及代谢阻力促进氯氰菊酯杀虫剂抗性

为了解在氯氰菊酯的选择压力下，Cx抗性株和敏感株差异蛋白的生理过程和结构域功能，对差异蛋白进行KEGG通路及结构域功能富集。结果显示，所有定量蛋白均明确显示在卵、幼虫、蛹和成虫发育阶段表达上调或下调（图4、5）。对抗性株及敏感株差异蛋白进行KEGG通路注释时发现，Hippo信号通路被激活并与14-3-3 zeta、F-肌动蛋白相关，氧化磷酸化被激活并与其电子传递链亚单位定量变化相关。此外，跨所有发育阶段的蛋白质组分析确定了参与渗透阻力的主要参与者，如表皮蛋白。研究中确定的代谢蛋白质，包括6种细胞色素P450、17种谷胱甘肽S转移酶（GST）和4种酯酶，也确定了代谢抵抗的其他关键蛋白，如TP结合盒亚家族解毒酶和抗氧化蛋白质。大量细胞骨架蛋白和核糖体蛋白也受到氯氰菊酯的影响，细胞骨架蛋白在不同发育阶段表现出显著的差异表达。结果表明，Cx对氯氰菊酯杀虫剂抗性主要是通过渗透及代谢阻力来实现的。

图4 氯氰菊酯抗性株和敏感株不同发育阶段差异蛋白KEGG通路富集热图

图5 氯氰菊酯抗性株和敏感株不同发育阶段差异蛋白结构域富集热图

本研究新开发的蛋白质组为淡色库蚊在四个发育阶段差异表达蛋白的研究提供了全面的资源，全现了抗性相关的角质层蛋白质、解毒酶和潜在候选代谢途径的蛋白质库，揭示了淡色库蚊对杀虫剂氯氰菊酯的抗性机制是通过渗透和代谢阻力实现。淡色库蚊对杀虫剂氯氰菊酯的抗性机制的发现，有利于改进防蚊控蚊策略，为防蚊控蚊提供了新的科学思路。