一、研究背景
二、研究手段
分别取86例tRCC样本的肿瘤（tumor）及癌旁正常组织（Normal adjacent tissues,NAT），提取蛋白进行蛋白质组及磷酸化蛋白质组学分析，提取DNA进行转录组及全外显子（whole-exome sequencing，WES）测序，后进行多组学联合分析。
图1 技术路线
三、研究结果
1、Mit家族tRCC多组学概览
为了解tRCC于组学上的差异，分别进行Label-free蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析，转录组测序及全外显子测序（图2a）。样本中位年龄为34岁，49例(57.0%)为I/II期肿瘤，36例(41.9%)为III/IV期肿瘤，分别有5例和63例TFEB型及TFE3型tRCC。TFEB中的融合类型有CLTC、ACTB、NEAT1和EIF4A2，而复发TFE3的融合类型主要包括ASPSCR1、SFPQ、NONO、PRCC、MED15、LUC7L3（图2b）。以癌旁正常组织为对照，筛选WES中的显著突变基因（significantly mutated genes，SMGs）， BCDIN3D, NDRG1,ZNF668和GNPTG均为tRCC的SMGs（图2c）。本次样本共检测到14073种蛋白质，其中11471种蛋白质为肿瘤组织和NAT共有；共识别到33853个磷酸基，对应6469个蛋白（图2d,e）。本次共识别到7206对mRNA-蛋白质对，基因集富集分析（GSEA）表明，正相关的mRNA-蛋白质对应基因富集于肾脏升高蛋白、Gly/Ser/Thr代谢和细胞外基质(ECM)受体相互作用，而负相关的基因富集于蛋白酶体和氧化磷酸化（图2f）。
图2 Mit家族tRCC多组学景观
2.不同部位组织tRCC分子特征
为比较肿瘤组织和NAT的差异，进行分子特征比较分析。主成分分析的结果表明，两个部位的转录组和蛋白质组水平具有明显的差异（图3a,b）。肿瘤组织中，TFE3只在蛋白水平上调，而在mRNA水平上则没有（图3c）。鉴定到差异蛋白共1727个，相对NAT上调蛋白为891个，下调蛋白为836个（图3d）。对差异蛋白进行富集分析，结果表明，肿瘤中涉及中性粒细胞脱颗粒、mTOR信号通路和溶酶体功能等上调；脂肪酸降解、TCA循环和呼吸链等下调（图3e）。在mRNA和蛋白质水平上，多种代谢途径(包括氨基酸、脂肪酸和葡萄糖代谢)发生一致改变（图3f）。而mTOR信号通路和氧化磷酸化存在显著的mRNA和蛋白表达解耦（图3f,g）。严格筛选蛋白质数据后，拟22个候选tRCC生物标志物（图3h,i）。肿瘤组织有221个磷酸化位点显著上调，激酶底物富集分析（KSEA）的底物磷酸化水平可用于推断激酶活性，激酶RPS6KB1是mTOR信号传导的重要效应因子，其激活进一步支持了mTOR通路是tRCC的潜在治疗靶点（图3j,k）。
比较tRCC与其他RCC亚型，发现tRCC的肿瘤突变负担（tumor mutational burden,TMB）较低，染色体不稳定性（chromosome instability,CIN）最低。为研究内源性和外源性诱变对tRCC基因改变的贡献，使用非负矩阵分解分解了突变谱，与tRCC肿瘤中最匹配的突变特征是SBS26、SBS6、SBS40和SBS22。SBS6和SBS26与DNA错配修复(MMR)缺陷相关（图4a）。四个突变特征都与TMB显著相关，仅Sig2 (SBS6)与CIN显著相关，同时，SBS6和CIN与无进展生存期(progression free survival,PFS)不良相关(图4b,c)。在蛋白水平上研究SBS6的原因，发现DNA修复相关蛋白ATM、DDB1、PARP1、XRCC5和CUL4A在SBS6肿瘤中显著下调（图4d）。SBS6与氧化磷酸化呈负相关，于氧化损伤上相反（图4e）。受损的氧化磷酸化与tRCC肿瘤中氧化损伤的增加相关，证实了相关推断（图4f）。而SBS6肿瘤中受损的谷胱甘肽(GSH)合成相关酶(GSR, GSS, GCLC)进一步加强了SBS6与tRCC氧化损伤的相关性（图4g）。总之，SBS6特征的tRCC因线粒体功能障碍产生的ROS、GSH合成受损、DNA修复缺陷和DNA损伤增加导致进一步损伤的潜在传播（图4h）。
图4 突变特征和相关信号通路识别
4.体细胞拷贝数改变及其蛋白质组学影响
用GISTIC方法鉴定tRCC中的体细胞拷贝数变异（somatic copy number alterations，SCNA），本次共鉴定出14个臂级SCNA,其中包括1q、5p和5q增加，以及 4 q、9p和9q等的减少（图5a）。焦点SCNA结果显示，染色体1p的细胞带(1p13.2, 1p36.12, 1p36.21)包含最常缺失的焦点区域（图5b）。使用Cox回归来确定显著CNA与临床结果之间的相关性，结果表明，6q、18p、18q等的缺失以及1q和5p扩增显示较差的PFS（图5c）。染色体3p缺失展现较差的临床结果，GSEA结果显示，与3p拷贝数呈正相关的蛋白富集于聚集体自噬，呈负相关的蛋白富集于补体和凝血级联（图5d）。在3p缺失的肿瘤中观察到调节自噬的ULK1 S469上调，表明tRCC 中3p缺失会造成自噬失调（图5e）。此外，ATG7丰度与主要组织相容性复合体II（MHC-Ⅱ）的丰度呈正相关（图5f）。3p中另一个重要的顺式效应发生在钙粘蛋白-连环蛋白复合体CTNNB1中，钙粘蛋白-连环蛋白复合物大部分下调与较差的PFS有关（图5g）。钙粘蛋白-连环蛋白复合物在细胞粘附中起重要作用，它的下调会致使肿瘤转移发展。
图5 tRCC体细胞拷贝数变异分析
5.不同tRCC融合类型的蛋白质组学差异
为研究不同tRCC亚型间的差异，对TFEB和TFEB进行蛋白质组学分析。TFE3型中有20个上调蛋白，TFEB型中有518个（图6 a）。TFEB在TFEB-trcc中尤其过表达，其对应活性也更强，而TFE3的丰度和活性没有显示出显著差异（图6 b,c）。富集分析显示TFEB-tRCC中糖酵解、糖异生、中性粒细胞脱颗粒、内吞作用、坏死和膜运输上调；在TFE3-tRCC中，钙调蛋白依赖性蛋白激酶活性上调（图6 d）。不同TFE3基因融合具有不同的蛋白质组学特征，ASPSCR1-TFE3 tRCC中，急性期反应(C1S, C1QC)和抗原呈递(TAP1, TAP2)上调，SFPQ-TFE3 tRCC在泛素-蛋白酶体系统(UBB, UBC, PSMB7)中显示升高（图6 e）。TFE3活性和肾脏特征评分在不同tRCC融合类型之间存在差异，与患者预后显著相关，SPSCR1-TFE3和LUC7L3-TFE3融合肿瘤具有更高的TFE3活性，而肾脏特征评分较低（图6 f，g）。ASPSCR1和LUC7L3融合比其他融合类型的肿瘤相比，显示较低的生存可能（图6 h）。
图6 tRCC不同亚型间的蛋白质组学差异
6.tRCC的蛋白质组亚型
由于肿瘤间具有高度异质性，对tRCC实施分子分型是必要的。基于蛋白质组学的数据，进行聚类分析，得到GP1、GP2、GP3共3种亚型。GP1的Ⅲ期和Ⅳ期肿瘤比例最高，而GP2的Ⅰ期和Ⅱ期肿瘤比例最高（图7a）。蛋白质组亚型在总生存期（overall survival,OS）和PFS上存在显著差异，GP1的OS和PFS最短，GP3的PFS较短，但OS较长(图7b)。对每个亚型中上调蛋白进行过表达分析，GP1上调蛋白在补体和凝血级联、血小板脱颗粒和先天免疫系统等途径中富集；GP2更多地与代谢途径升高相关；GP3模块中，与肿瘤增殖和蛋白质稳态相关的通路被富集(图7c)。对拷贝数变异进行探讨，结果表明，9q和14q的缺失在GP1中聚集，12p和12q的扩增在GP1和GP3中聚集(图7a,d)。对GP1中最常见的9q缺失进行GSEA分析，结果表明，补体激活在9q缺失的肿瘤中富集，而氧化磷酸化非9q缺失的肿瘤中富集(图7e)。ATP6V1G1 (9q32)编码ATP酶的一个组分，表现出显著的CNA顺式效应(图7f)。此外，ATP6V1G1丰度与临床结果显著相关(图7g)。
图7 基于蛋白质组学的tRCC分子分型
7、tRCC的免疫浸润特征
为了研究tRCC的免疫浸润特征，基于推测肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中不同细胞类型的相对丰度，进行聚类分析，得到IM1、IM2和IM3共3种免疫亚型。免疫亚型与蛋白质分型有显著相关性，反映了TME对蛋白质表达模式的影响(图8a)。与蛋白质组学聚类一致，免疫亚型与临床结果显著相关，其中IM1的OS最低(图8b)。补体级联和上皮细胞间充质转化（EMT）水平在IM1肿瘤中增强，进一步证实TME中的成纤维细胞可以增强肿瘤细胞的EMT(图8c,d)。IM1肿瘤14q和9q缺失的频率较高，两者都与不良预后相关(图8e)。探究14q拷贝数对蛋白质的影响，结果显示，蛋白酶体最为相关，表现为19个蛋白酶体组分与14q 拷贝数间存在显著相关性(图8f，g)。由于蛋白酶体在蛋白质周转中起重要作用，进一步探究蛋白酶体与tRCC中蛋白质丰度之间的关系，结果表明，EMT相关蛋白丰度和EMT评分与蛋白酶体呈负相关(图8h，补充图7i（未显示）)。综上所述，14q缺失调控了tRCC中EMT和IM1类微环境，与不良预后相关(图8i)。
图8 tRCC的免疫浸润
四、结论
本次研究展示了tRCC肿瘤和正常邻近组织的综合蛋白质基因组分析，以阐明疾病的分子景观。DNA修复缺陷在tRCC的发生和发展中起着重要作用，代谢过程在mRNA和蛋白质水平上均明显失调，蛋白质组学和磷蛋白质组学数据确定mTOR信号通路是一个潜在的治疗靶点。此外，分子分型和免疫浸润分析表征了tRCC的肿瘤间异质性，多组学整合揭示了受基因组改变影响的细胞过程的失调，整体为tRCC的生物学机制、疾病诊断和预测提供了有价值的见解。
参考文献
Qu Y, Wu X, Anwaier A, et al. Proteogenomic characterization of MiT family translocation renal cell carcinoma. Nat Commun. 2022 Dec 5;13(1):7494.
